化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的規(guī)范操作方法

2022

07-02

22:00:02

 45

來源：賽爾瑞成（北京）生命科學(xué)技術(shù)有限公司

　　化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞是常規(guī)克隆和亞克隆實驗應(yīng)用較為合適的解決方案。經(jīng)氯化鈣處理，促進(jìn)質(zhì)粒DNA黏附于感受態(tài)細(xì)胞膜上。將感受態(tài)細(xì)胞通過水浴熱激，使細(xì)胞膜孔打開，從而質(zhì)?？梢赃M(jìn)入。

　　操作方法：（以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

　　1、取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100μl，可以根據(jù)實際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。

　　以下實驗以100μl感受態(tài)細(xì)胞為例。

　　2、向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA（50μl的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和），輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置30分鐘。

　　3、將離心管置于42℃水浴中放置90秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，該過程不要搖動離心管。

　　4、向每個離心管中加入500μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘（150轉(zhuǎn)/分鐘），目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

　　5、將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時。

　　注：涂布用量可根據(jù)具體實驗來調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計的克隆較少，可通過離心（4,000rpm,2分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）

　　注意事項：

　　1.進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件的要求進(jìn)行。

　　2.感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可多次凍融和放置時間過長，以避免感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

　　3.為防止轉(zhuǎn)化實驗不成功，可以保留部分連接反應(yīng)液，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到很低的程度。

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