Bradford法總蛋白含量測試試劑盒分光光度計法使用說明

Bradford法總蛋白含量測試試劑盒

（C003-100T 分光光度計法）

一、測定原理

在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)G250（Coomassie brilliant blue G250）染料主要與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是*和賴氨酸）和芳香族氨基酸的殘基通過疏水力相結(jié)合，從而使染料的大吸收峰由波長465nm變?yōu)椴ㄩL595nm，溶液的顏色由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色。在一定蛋白濃度范圍內(nèi)，溶液在波長595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可通過測定樣品在波長595nm的吸光度計算樣品的蛋白質(zhì)濃度；然后根據(jù)公式計算生物樣品的可溶性蛋白質(zhì)含量。

二、試劑組成

試劑一：顯色液 200ml×2瓶

試劑二：2.5mg/ml結(jié)晶牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品，0.5ml×1瓶

三、儲存條件及有效期

試劑一：4℃避光保存；試劑二-20℃保存?？杀４?2個月。

四、試劑的配制

標(biāo)準(zhǔn)品的配制：在試劑二瓶中加入4.5mL雙蒸水，充分混勻，得到5ml濃度為250μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。分別移取0，100，200，300，400，600，800，1000μL于空試管中，加入1000，900，800，700，600，400，200，0μL雙蒸水，得到0，25，50，75，100，150，200，250μg/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液。

五、操作步驟

六、計算方法

1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度0，25，50，75，100，150，200，250μg/ml為橫坐標(biāo)，以酶標(biāo)儀測得的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到方程，一般認(rèn)為相關(guān)系數(shù)（R²）大于0.99可用。實測得標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

2. 計算樣品濃度

由計算得到的方程求樣品濃度。

七、注意事項

1. 染色液接觸皮膚后較難清洗，請務(wù)必戴手套操作。本實驗用過的比色皿及試管請在實驗結(jié)束后盡快使用酒精清洗，避免比色皿被染色。

2. 本方法靈敏度高，可以測定低至25μg/mL的蛋白質(zhì)濃度，蛋白濃度過高會超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，務(wù)必稀釋后測定。*標(biāo)曲范圍0-250μg/mL，但實測0-500μg/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)曲相關(guān)系數(shù)通常能夠達到要求以上。具體范圍請用戶根據(jù)標(biāo)曲制作情況判斷。

3. Bradford法測定蛋白濃度不受一般濃度還原型試劑如β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)影響；但受去垢劑影響。如樣品處理時加入過SDS、Triton X-100、Tween 等試劑，建議改用其它方法如BCA法測定。